Ek wil begin met 'n herinnering wat dikwels in openbare besprekings verlore raak: Die Covid mRNA-entstowwe is werklik nuwe mediese produkte.
Voor die noodmagtigings in 2020 is mRNA-entstoftegnologie nog nooit op skaal op mense ontplooi nie. Slegs twee kliniese proewe, een van Pfizer-BioNTech en een van Moderna, het hierdie platform ooit op mense getoets. Altesaam 37 000 individue het ooit 'n mRNA-entstof in die geskiedenis van medisyne ontvang (die vroeëre ervaring met hondsdolheid-, CMV- en kankerentstowwe, wat beperk is tot baie kleiner vroeëfase-studies, is nie ingesluit nie). Dit is nie 'n kritiek nie; dit is bloot 'n feitestelling. Maar dit beteken wel dat die langtermynveiligheidsprofiel van hierdie produkte onvolledig verstaan is en steeds is.
Wat volg, is bekend aan byna alle molekulêre bioloë. Dit is ingewikkeld, maar ek probeer dit vereenvoudig gegewe die risiko's. Dit is belangrik om die molekulêre raamwerk duidelik vir almal uiteen te sit, want hoe hierdie entstowwe gemaak word, bepaal direk wat binne-in die flessie is.. En wat binne-in die flessie is, sodra dit ingespuit is, sal deur die liggaam reis en 'n kaskade van gebeure aktiveer wat tot langtermyn gesondheidsimplikasies kan lei.
In Vitro Transkripsie is nie net 'n vervaardigingsdetail nie
Gemodifiseerde mRNA-entstowwe word vervaardig deur 'n proses genaamd in vitro-transkripsie (IVT) te gebruik.)IVT is die metode wat gebruik word om die gemodifiseerde mRNA te sintetiseer wat uiteindelik die aktiewe bestanddeel in die entstof word.
Dit is nie 'n triviale tegniese detail nie. IVT vorm fundamenteel die molekulêre samestelling van die finale produk.
Wetenskaplikes by BioNTech, insluitend diegene wat direk betrokke was by die ontwikkeling van die Pfizer-entstof, het 'n gedetailleerde oorsig gepubliseer1 wat beskryf hoe IVT-reaksies nie net die beoogde vollengte mRNA genereer nie, maar ook 'n reeks neweprodukte en onsuiwerhede, hoe hierdie tipies verwyder word, en wat hul biologiese gevolge kan wees as hulle voortduur. Hierdie vervaardigingsaanwysings, tesame met die neweprodukte wat hulle skep, is ook in detail deur Moderna in hul patente beskryf (US10,653,712 B2 en US10,077,439 B2). Maar nog belangriker, hierdie molekulêre biologie was lank voor Covid goed gevestig. Niks hiervan is spekulatief nie.
Die Beginmateriaal: DNS-sjablone
In sy kern begin 'n IVT-reaksie met dubbelstrengige DNS wat die verlangde proteïen kodeer. In hierdie geval, die SARS-CoV-2-piekproteïen.
Die piekkoderende volgorde wat in mRNA-entstowwe gebruik word, is geneties gemodifiseerde om stabiliteit en sellulêre toleransie te verbeter, insluitend twee aminosuursubstitusies wat dit onderskei van die virale piek. Daardie wysiging is opsetlike.
Die DNS-sjabloon self kan verskillende vorme aanneem. Tydens Pfizer se vroeë kliniese proewe is PCR-gegenereerde DNS-fragmente gebruik. Die kommersiële vervaardigingsproses het egter staatgemaak op DNS afgelei van plasmiede. Dit is belangrik omdat plasmiede addisionele regulatoriese volgordes bevat. In Pfizer se geval sluit dit elemente soos die SV40-promotor en ori-volgordes in, wat kommer wek as hulle menslike selle sou binnedring.
Sodra hierdie DNS-templaat by die IVT-reaksie gevoeg is, saam met RNS-polimerase en ander komponente, word dit na mRNA getranskribeer (Figuur 1).
IVT Produseer Byprodukte volgens Ontwerp
Terwyl die verlangde uitset van IVT die beoogde vollengte mRNA-produk is, is die werklike uitset meer kompleks. Dit sluit verskeie neweprodukte in in die vorm van (1) verskeie RNA-spesies, insluitend dubbelstrengige RNA (dsRNA), (2) DNA wat aan RNA geheg is (RNA-DNA-hibriede), en (3) die vrye DNA van die oorspronklike sjabloon (Figuur 2).
Die vorming van hierdie neweprodukte is goed gedokumenteer en onvermydelik, en daarom is suiwering stroomaf absoluut noodsaaklik vir veiligheid.
Figuur 2. Byprodukte en kontaminante van IVT-vervaardiging. Beeld aangepas van 1.
Suiwering het bekende beperkings
Na vervaardiging is daar twee suiweringstappe nodig om eers die DNS en dan die RNA-byprodukte te verwyder (Figuur 3):
Figuur 3. Verwydering van IVT-byprodukte. Beeld aangepas van 2.
Om die DNS te verwyder, word 'n ensiem genaamd DNase I by die reaksiemengsel gevoeg, wat algemeen gebruik word om besoedelende DNS af te breek. Terwyl DNase I effektief is teen die vrye templaat-DNS, toon verskeie studies, insluitend werk deur BioNTech-wetenskaplikes self, dat DNase I ondoeltreffend is om die DNS wat aan RNS geheg is (RNS-DNS-hibriede) te verwyder.
Hierdie beperking is nie kontroversieel nie. Dit is in die literatuur gedokumenteer.
Wat onafhanklike ontledings getoon het
Hierdie konteks is van kritieke belang vir die interpretasie van onlangse onafhanklike ontledings van voltooide entstofflessies.
navorsers3 en reguleerders4 het berig dat DNA-kontaminante in feitlik elke getoetste flessie opgespoor is. Hierdie kontaminante het beide dubbelstrengige DNA en RNA-DNA-hibriede ingesluit wat bestand was teen DNase I-vertering.
In sommige monsters was spykerkoderende DNS teenwoordig op vlakke van meer as 100 keer hoër as ander plasmiedvolgordes.5, wat dui op ongelyke of onvolledige vertering. Volgordebepaling en kwantitatiewe PCR-analises het verder DNA-fragmente opgespoor wat gemiddeld ~200 basispare lank was, met sommige wat 4 kilobases oorskry het. In verskeie gevalle is volgordes wat byna die hele plasmied omspan, waargeneem.
Saamgevat laat hierdie bevindinge ernstige vrae ontstaan oor die konsekwentheid en volledigheid van suiwering tydens grootskaalse vervaardiging, en oor die potensiële biologiese gevolge van oorblywende nukleïensure in mense.
Waarom Nukleïensuurbesoedelingstowwe Biologies Belangrik is
RNS en DNS is kragtige aktiveerders van aangebore immuunbane. Dit is nie spekulatief nie. Patroonherkenningsreseptore en die cGAS-STING-roete reageer kragtig op vreemde nukleïensure, wat inflammasie, groeiremming en selfs seldood veroorsaak.
Hierdie meganismes is presies waarom geenterapieprodukte onderhewig is aan streng veiligheidsmonitering.
Ironies genoeg is die Covid mRNA-entstowwe ontwerp met wysigings spesifiek om hierdie kragtige aangebore immuunaktivering te verminder. Maar RNA-DNS-hibriede en DNA-fragmente sal steeds sterk immuunresponse uitlok ten spyte van daardie wysigings.
Volharding laat nuwe vrae ontstaan
Daar is nou aansienlike bewyse wat toon dat piek-mRNA en -proteïen vir weke, maande en selfs jare na inenting in menslike weefsels voortduur (Tabel 1).
Ons weet nog nie of hierdie volharding langdurige mRNA-stabiliteit, voortgesette translasie of DNS-gebaseerde meganismes weerspieël nie. Maar gegewe die geloofwaardigheid van DNS-integrasie en langlewende nie-geïntegreerde plasmied-DNS in spierselle,6 Dit is nie onredelik om aan te neem dat die volharding van Spike mRNA, proteïen en teenliggaampies teen Spike jare na inenting nie onverwant is aan die DNA-onsuiwerhede en neweprodukte na IVT nie.
Tabel 1. Spike mRNA en proteïenpersistensie na inenting in mense
Kort- en langtermyn veiligheidsimplikasies
Saamgevat gee hierdie data aanleiding tot verskeie belangrike veiligheidsoorwegings.
Eerstens is akute immuunreaksies, insluitend sitokienstorms en anafilakse, onmiddellik na inenting aangemeld. Sulke sterk inflammatoriese reaksies moet nie sommer afgemaak word as onverwant aan onsuiwerhede nie, veral gegewe wat bekend is oor nukleïensuur-geïnduseerde immuunaktivering.
Tweedens, en meer krities, is langtermynrisiko's. Aanhoudende piekuitdrukking kan waarskynlik bydra tot chroniese immuunsindroom. Nog meer kommerwekkend is die moontlikheid van DNS-integrasie, wat risiko's van insersionele mutagenese of geenontwrigting inhou. Dit beteken 'n risiko vir kanker of ontwikkelingsdefekte, afhangende van waar en op watter ouderdom die DNS geïntegreer is.
Dit is opmerklik dat die FDA self in sy inligtingsblaaie verklaar dat hierdie entstowwe nie is geëvalueer vir karsinogenisiteit (kankervorming) of genotoksisiteit (DNS-skade), 'n punt wat roetine sou wees en verwag word in geenterapie-toesig, waar langtermynmonitering standaard is.
Die Regulatoriese Gaping rondom DNS in mRNA-entstowwe
Aangesien daar werklik geen dispuut meer is dat oorblywende DNS in mRNA-entstowwe bestaan nie, is die vraag of huidige riglyne en veiligheidslimiete gepas is vir mRNA-entstowwe. Ons is verseker dat die DNS-byprodukte binne die perke val wat in die regulatoriese riglyne uiteengesit word. So, wat is die FDA-riglyne rondom DNS-byprodukte en kontaminante?
Die mees algemeen aangehaalde FDA-riglyne oor oorblywende DNS (≤10 ng per dosis) is ontwikkel vir virale entstowwe wat in lewende selle geproduseer word wat gefragmenteerd en "naak" is, met beperkte vermoë om menslike selle binne te dring. MRNA-entstowwe word egter nie in selle geproduseer nie, hul oorblywende DNS is nie van die gasheersel afgelei nie, en die belangrikste is dat die DNS in die mRNA-entstowwe nie naak is nie. Dit word geassosieer met LNP-afleweringstelsels, wat dit spesifiek baie maklik maak vir die DNS om binne-in selle te kom. Die FDA se 2010-riglyne is duidelik dat dit nie 'n relevante veiligheidsdrempel vir DNS wat met LNP-gebaseerde produkte geassosieer word, vasstel nie.
Die ander algemeen aangehaalde riglyne is van die WGO vir rekombinante proteïenterapeutiese middels wat oorblywende DNS in produkte soos monoklonale teenliggaampies of hormone wat in gemanipuleerde selle geproduseer word, aanspreek. Hier weer eens is die oorblywende DNS afkomstig van gasheerselle of ekspressieplasmiede, is teenwoordig as spoor, nie-ingekapselde DNS (naak), en die finale produk is 'n gesuiwerde proteïen, nie 'n nukleïensuur-gebaseerde terapie (mRNA-entstof) nie. Dus is hierdie riglyne nie van toepassing op mRNA-entstowwe nie.
Nóg die FDA nóg die WGO regulatoriese standaarde wat die meeste vir oorblywende DNS aangehaal word, was ontwikkel vir mRNA-entstowwe, en spreek nie direk hierdie veiligheidskwessie aan nie.
Wat die WGO oor mRNA-entstowwe gesê het — na ontplooiing
In 2022 het die Wêreldgesondheidsorganisasie riglyne uitgereik wat spesifiek mRNA-entstowwe aanspreek.7Dit is opmerklik dat hierdie dokument vrygestel is na die wêreldwye bekendstelling van hierdie produkte. Dit meld spesifiek dat hierdie riglyne in reaksie was op: “die veiligheids-, produksie- en regulatoriese kwessies wat met hierdie nuwe tegnologie verband hou.Die dokument maak ook verskeie belangrike stellings:
"Omdat gedetailleerde inligting nog nie beskikbaar is oor die metodes wat vir produksie gebruik word nie, kontroles nog nie gestandaardiseer is vir veilige en doeltreffende mRNA-entstowwe nie, en sekere besonderhede steeds eiendomsreg en dus nie publiek beskikbaar is nie, is dit nie haalbaar om spesifieke internasionale riglyne of aanbevelings op hierdie tydstip te ontwikkel nie."
Dit lui verder: “Die gedetailleerde produksie- en beheerprosedures ... moet met die NRA [Nasionale Reguleringsowerheid] bespreek en goedgekeur word.] op 'n individuele geval-tot-geval basis."
Die WGO erken dat beheermaatreëls vir mRNA-entstowwe nog nie gestandaardiseer is nie en dat dit nie haalbaar was om spesifieke internasionale riglyne of aanbevelings vas te stel nie. Verder is regulatoriese toesig nodig vir geval-tot-geval-evaluering deur nasionale owerhede.
Dit is gesê nadat die mRNA-entstowwe ontplooi is.
En ten tyde van die skryf van hierdie Substack het die FDA nog steeds nie gestandaardiseerde riglyne vir mRNA-entstowwe opgestel en enige bewyse en veiligheidsgebaseerde data verskaf om enige beperkings van DNA in mRNA-entstowwe te ondersteun nie.
Laastens, dit is die moeite werd om te herhaal: hoewel mRNA-tegnologie nie nuut is nie, is dit voor Covid gereguleer as geenterapie, nie as 'n tradisionele entstof nie. Die veiligheidskwessies rondom die DNS-byprodukte in Covid-entstowwe gaan dieselfde wees met enige mRNA-entstof, insluitend dié vir griep, RSV, of selfs mRNA-entstowwe vir kanker.
Dit is omdat mRNA-produkte fundamenteel verskil. Hulle moet selle binnedring en hulle opdrag gee om 'n vreemde proteïen te produseer. Dit is anders as enige ander konvensionele entstowwe wat die proteïen direk aflewer. Daar is geen kliniese presedent vir hierdie platform nie, en daar is geen kliniese presedent vir herhaalde dosering nie. En beslis geen presedent op bevolkingsskaal nie.
In hierdie stadium, sonder 'n pandemie, die toenemende meganistiese data en kliniese waarnemings, en die verspreiding van mRNA-entstofprodukte wat die mark tref, benodig ons deursigtigheid en direkte betrokkenheid by ernstige veiligheidsstudies van reguleerders, veral die FDA wat kritieke riglyne vir die vervaardiging van hierdie produkte vasstel – veral wat DNA-byprodukte betref.
Nuwe tegnologie vereis nuwe ondersoek – nie stilte, gasligting of sensuur nie.
Verwysings
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 2022 4 April;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Opsporing van integrasie van plasmied-DNS in gasheer-genomiese DNS na intramuskulêre inspuiting en elektroporasie” (Gene Therapy, 2004). In muise is naakte plasmied-DNS intramuskulêr ingespuit, gevolg deur elektroporasie om opname te verbeter. Deur 'n hoogs sensitiewe PCR op gesuiwerde genomiese DNS te gebruik (met gelskeiding om ekstrachromosomale vorms te verwyder), het die outeurs vier onafhanklike integrasiegebeurtenisse 4 weke na inspuiting geïdentifiseer. Verbindingsvolgordebepaling het ewekansige integrasieplekke (geen voorkeur-brandpunte) bevestig, in ooreenstemming met nie-homoloë eindverbinding. Die integrasiefrekwensie was laag, maar meetbaar. Dit is een van die duidelikste demonstrasies van werklike spontane integrasiegebeurtenisse in vivo vir naakte plasmied-DNS in spiere. Dit is noemenswaardig – hierdie studie het verbeterde DNS-aflewering via elektroporasie gebruik, wat vergelyk kon word met die verbeterde aflewering via LNP's.
Martin et al. (1999) – “Plasmied-DNS-malaria-entstof: Die potensiaal vir genomiese integrasie na intramuskulêre inspuiting” (Menslike geenterapie). Hierdie vroeëre studie het plasmied-DNS IM in muise getoets en Southern blot-hibridisasie en PCR op hoë-molekulêre gewig genomiese DNS gebruik om integrasie te ondersoek. Terwyl volharding meestal ekstrachromosomaal was, het hulle bewyse gerapporteer wat dui op seldsame integrasie in sommige monsters (alhoewel nie so definitief georden soos latere werke nie). Dit het 'n maatstaf vir lae risiko gestel, maar het die potensiaal vir baie lae-frekwensie gebeurtenisse erken, wat daaropvolgende FDA-riglyne oor DNS-entstowwe beïnvloed het.
Ledwith et al. (2000) – “Plasmied-DNS-entstowwe: Ondersoek na integrasie in gasheer-sellulêre DNS na intramuskulêre inspuiting in muise” (Intervirologie). Naakte plasmied-DNS wat intramuskulêr in muise ingespuit is, het getoon dat geen waarneembare integrasie waargeneem is nie, maar DNS is steeds in die quadriceps-spier tot 26 weke opgespoor. Die DNS was ekstrachromosomaal.
7 WGO-deskundigekomitee oor biologiese standaardisering 74ste verslag Aanhangsel 3. Evaluering van die gehalte, veiligheid en doeltreffendheid van boodskapper-RNA-entstowwe vir die voorkoming van aansteeklike siektes: regulatoriese oorwegings https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser is 'n vooraanstaande professor in die Departement Ontwikkelings-, Molekulêre en Chemiese Biologie aan die Tufts Universiteit se Skool vir Geneeskunde en die direkteur van die Tufts Konvergensielaboratorium by Tufts. Dr. Kuperwasser word internasionaal erken vir haar kundigheid in melkklierbiologie en borskanker, en voorkoming. Sy is 'n lid van die Advieskomitee oor Immuniseringspraktyke.
Kyk na alle plasings
